Dag (1)
Dag (1)Rening av rekombinant plasmid enl. Qiagen samt koncentrations och
renhetsbestämning av plasmid preparationen .
1. Idag har du renat en rekombinant plasmid från en
bakteriesuspension.
Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
Vi
har renat en rekombinant Bluescript gen med
LL37 från en bakteries suspension (E.
coli ). Och under rening av plasmid har vi tagit bort celldebris, proteiner,
RNA och kromosomalt DNA med två steg:Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?
a)Alkalisk denaturering: vi gör den
här för att bryta vätebindingarna i det kromosomala DNAt , samt att göra ett hål i bakteriens
lipidmembran så att innehållet läcker ut. Sen vi tillsätts acetatbuffert för
att de brutna väte bindningar fogar samman. Pellet efter centrifugeringen ger
kromosomalt DAN, proteiner och celldebris. Plasmider, RNA och vissa proteiner
är kvar i supernatant .
b)Rening
på glasfiberkolmn : plasmiderna separerar
från det kromosomala DNA och därför centrifugeras plasmiderna genom en
silkonkolmn. Plasmiderna har negativt laddning och därför binder dessa till
filtret. Plasmidernas negativa fosfat grupper sitter hårdare än RNA och
proteiner som man kan lätt tvätta bort dem mha en buffert. Sedan tillsätts en
EB-buffert för att plasmiderna inte ska vara bundna till kolmn.
2.Vad vet du om resultat? Fick du ren plasmid?
2.Vad vet du om resultat? Fick du ren plasmid?
Plasmids renhet och kocentration
mätts mha spektrofotometri . Om kvoten ligger mellan (1,8–1,9) så betyder det att plasmidslösning är fri från proteiner och det är tvärtom om kvoten är mindre än 1,8. Vår kvoten är 1,88 och det är okej vilket betyder det att vi har en ren plasmid från proteiner. Men vi vet inte om det är rent från RNA och vi kan bekräfta detta mha kontroll gelelektrofores. Vår resultat är i detaljer:
 |
| Absorbance för plasmids spädning |
·
Absorbansvärde vid 260 nm var 0,047,
absorbansvärde vid 280nm var 0,025
·
Renhet = A260 / A280
=0,047/0,025
=1,88 och detta innebär att vi
har en ren plasmid.
. 1 absorbansenhet vid 260nm motsvarar 50 µg DNA/ml
. 1 absorbansenhet vid 260nm motsvarar 50 µg DNA/ml
50 ∙ µg/1000 µl =
0,05µg/µl
. A 260=0,047
. C (plasmid) = 0,047 ∙ 0,050
. A 260=0,047
. C (plasmid) = 0,047 ∙ 0,050
= 0,00235µg/µl
Efter spädning = 0,00235µg/µl∙100
Efter spädning = 0,00235µg/µl∙100
= 0,235 µg/µl
3.
Är det något du funderar på som du vill att vi
tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen? Nej
upplagd av fulla @ 13:10
3 kommentarer
3 kommentarer:
Bra med noggrann redogörelse för de olika momenten och hur de gick till. Ganska lång text men bilderna och de olika typsnitten på frågor och text gör att det ändå är lätt att läsa, trots några stavfel.
Hej Fulla!
Jag håller med dig om att det inte finns protein föroreningar i ditt rör, men vi kan inte veta om det finns ren plasmid eller inte, eftersom det i röret kan finnas också kromosomal DNA som absorberar vid 260nm. Det måste först utföras en gelelektrofores för att påstå att lösningen innehåller ren plasmid som förhoppningsvis finns i röret.
Mvh Olga
Hej Fulla och andra!
Bra att du skriver att den enda förorening som vi kan upptäcka vid absorbansmätning är proteiner. Som du påpekar kan det finnas RNA, som inte upptäcks vid absorbansmätning, och Olga har rätt i att det även kan finnas förorening av kromosomalt DNA. Därför tycker jag det är missvisande att kalla kvoten A260/A280 för "Renhet", det vore bättre att skriva "Ev. proteinförorening" tycker jag.
Märit
Skicka en kommentar
Prenumerera på Kommentarer till inlägget [Atom]
<< Startsida