Dag 3 och 4

 Under dag 3 och 4 har vi gjort: random priming + southern blot som innehåller olika momenter :( gelelektrofores , southern transfer ,fixering av DNA till membran, prehybridisering,hybridisering)+ Stringenstvätt + Detektion

 

Southern blot membran
 

 Bilden ovan visar membran och brunnar från vänster till höger är oklyvd plasmid, M III, klyvd plasmid, M IX). I den oklyvda plasmiden spalt ser vi ett band som innehåller inserten LL37 men de andra banden är en annan form av den plasmid t.ex open circular.

I M III och XI spalten finns det inget band och det tyder att vi har lyckats med stringenstvätt och proben har bundit specifikt till de klyvda och oklyvda plasmider som innehåller LL37.

Vi har bara en spalt av den klyvda plasmiden (0,005mikrogram) som den visas som ett band i bilden. Mendan vi har glömt den klyvda plasmiden  (0,5 mikrogram) och därför man inte kan ser det.

Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta reda på om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Vi har lyckats med PCR och Southern blot att bevisa att vårt plasmid innehåller LL37. Men vid jämförelse med både metoder kan man säga att PCR utförande är lättast och snabbare än den andra metoden.Medan de låga koncentrationer av 0,005 mikrogram av den klyvda plasmid kan ses i membranet när vi utfört southern blot. Och det är därför att denna metoden är känsligare än PCR. Men eftersom southern blot innehåller många momenter är det en stor risk att man göra fel under utförande av metoden.

 

2-Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?
Jag har lärt mig att följa instuktioner när vi har labat under dagar (3 och 4)  eftersom de innehåller olika momenter. Och man måste vara noggran under utförande för att undvika fel som följden blir att man inte får bra resultat.

 Idag har du utfört en PCR.

- Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

 Brunnarna från  vänster:1)  Markör III  (2) Eget prov (3)  MarkörVI (4)Positiv kontroll (5)Negativ kontroll  (6) Plasmid                                                  

 

gelelektrofores

 Den positiva kontrollen, som visat i bilden visar att PCR har fungerat bra. Den positiva kontrollens band som innehåller den kända LL37 genen har kommit i samma höjd som bandet hos det eget provet. Och därför kan vi konstatera att eget prov innehåller LL37.

 

Den negativa kontrollen ser bra ut här vilket betyder det att vi inte har carry over kontamination. Och Detta innebär att vårt resultatet är korrekt och man kan lita på det.

I den plasmids brunnen har vi fått ett tydligt band som visar plasmiden. Man kan inte jämföra den här bandet  med markören eftersom fragmenten i markören är linjära och plasmiden är cirkulär. De svagare banden som finns ovanför plasmidens band,visar också annan form av plasmiden (öppen cirkulär) än den supercoiled (cccDNA) plasmiden som vandrar snabare.
Inga spår av kromosomalt DNA eller RNA syns i gelen eftersom kromosomalt DNA inte har visat sig nära brunnen och RNA i andra ändan av brunnen inte har visat sig i form av en smear. Vi kan konstatera att vi lyckats bra med reningen av plasmiden.

 

Dag (1)

  

Dag (1)Rening av rekombinant  plasmid enl. Qiagen samt koncentrations och renhetsbestämning av plasmid preparationen .

1. Idag har du renat en rekombinant plasmid från en bakteriesuspension.
Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Vi har renat en rekombinant  Bluescript gen med LL37 från en bakteries suspension  (E. coli ). Och under rening av plasmid har vi tagit bort celldebris, proteiner, RNA och kromosomalt DNA  med två steg:

a)Alkalisk denaturering: vi gör den här för att bryta vätebindingarna i det kromosomala  DNAt , samt att göra ett hål i bakteriens lipidmembran så att innehållet läcker ut. Sen vi tillsätts acetatbuffert för att de brutna väte bindningar fogar samman. Pellet efter centrifugeringen ger kromosomalt DAN, proteiner och celldebris. Plasmider, RNA och vissa proteiner är kvar i supernatant .

b)Rening på glasfiberkolmn :  plasmiderna separerar från det kromosomala DNA och därför centrifugeras plasmiderna genom en silkonkolmn. Plasmiderna har negativt laddning och därför binder dessa till filtret. Plasmidernas negativa fosfat grupper sitter hårdare än RNA och proteiner som man kan lätt tvätta bort dem mha en buffert. Sedan tillsätts en EB-buffert för att plasmiderna inte ska vara bundna till kolmn.
     
2.Vad vet du om resultat? Fick du ren plasmid?



Absorbance för plasmids spädning

 Plasmids renhet och kocentration mätts mha spektrofotometri . Om kvoten ligger mellan (1,8–1,9) så betyder det att plasmidslösning är fri från proteiner och det är tvärtom om kvoten är mindre än 1,8. Vår kvoten är 1,88 och det är okej vilket betyder det att vi har en ren plasmid från proteiner. Men vi vet inte om det är rent från RNA och vi kan bekräfta detta mha kontroll gelelektrofores. Vår resultat är i detaljer:

·          Absorbansvärde vid 260 nm var 0,047, absorbansvärde vid 280nm var 0,025

·         Renhet = A260 / A280

                   =0,047/0,025

                   =1,88 och detta innebär att vi har en ren plasmid.
    
.   1 absorbansenhet vid 260nm motsvarar 50 µg DNA/ml

                   50 ∙ µg/1000 µl = 0,05µg/µl

.      A 260=0,047
 
.   C (plasmid) = 0,047 ∙ 0,050

                  = 0,00235µg/µl

Efter spädning = 0,00235µg/µl∙100

                                  = 0,235 µg/µl

 3. Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgång nästa labdag eller vid labuppföljningen? Nej

 

hejjjjjjj